Микробиологическое обоснование целесообразности применения эфирных масел лекарственных растений в лечении воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей

Резюме. Неоспорима роль нарушений микрофлоры респираторного тракта в качестве этиологического и патогенетического фактора развития воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей (ВДП), высока значимость факторов персистенции респираторных условно-патогенных микроорганизмов. Традиционное использование при патологии ВДП антибиотиков и антимикотических средств потерпело фиаско ввиду значительного роста количества антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов и развития ряда нежелательных побочных реакций у больных. Альтернативное преимущество в этих условиях приобретают препараты растительного происхождения. Целью нашей работы явилось сравнительное исследование in vitro антибактериальной и антимикотической активности растительных эфирных масел, входящих в композицию «Масло Дыши», и самой композиции «Масло Дыши» в отношении условно-патогенных микроорганизмов – возбудителей воспалительных заболеваний ВДП. 

Материалы и методы. В работе использовали эфирные масла гвоздики, можжевельника, перечной мяты, эвкалипта, а также композицию масел «Дыши». В качестве тест-культур использовали культуры бактерий Staphylococcus aureus АТСС 25923, Klebsiella pneumoniae ICIS-278, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и Candida albicans АТСС 24433. В качестве представителя нормобиоты ВДП был выбран штамм Staphylococcus epidermidis 25, изолированный от условно-здорового человека. Антимикробная активность эфирных масел определялась методом диффузии в питательном агаре, МПК-методом серийных разведений.

Результаты. Установлено наличие зон выраженной задержки роста золотистого стафилококка, клебсиеллы и псевдомонады, а также дрожжеподобных грибов при воздействии композиции масел Дыши, в то время как в отдельности используемые масла видимого влияния на рост бактерий и грибов не оказывали, что свидетельствует о синергидном взаимодействии входящих в состав препарата масел.

Выводы: Доказано наличие синергидного антимикробного действия композиции «Масло Дыши» в отношении условно-патогенных бактерий и дрожжеподобных грибов рода Candida. Отсутствие ингибирующего влияния на рост эпидермального стафилококка, являющегося представителем нормобиоты верхних дыхательных путей, свидетельствует о возможном избирательном эффекте масла «Дыши», направленном на поддержание колонизационной резистентности биотопа ВДП.

Ключевые слова: эфирные масла, заболевания ВДП, антимикробная активность, условно-патогенные микроорганизмы 

Введение 

В настоящее время лидирующее положение среди заболеваний респираторной системы занимает воспалительная патология верхних дыхательных путей (ВДП), включающая острый и хронический ринит, риносинусит, аденоидит, фарингит, тонзиллит, ларингит. Острые воспалительные заболевания ВДП могут вызывать более 300 различных микроорганизмов: вирусы, бактерии, атипичная флора (микоплазмы, хламидии, легионеллы, пневмоцисты) и грибы.

Респираторный тракт постоянно подвергается воздействию микроорганизмов посредством ингаляции, либо микроаспирации, при этом заболевание реализуется не всегда. Многочисленные исследования продемонстрировали наличие бактериальной ДНК как в верхних, так и в нижних отделах дыхательных путей, что служит доказательством существования здорового микробиома респираторного тракта. Неоспорима роль нарушений микрофлоры респираторного тракта в качестве этиологического и патогенетического фактора их развития, высока значимость факторов персистенции респираторных патогенов (Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenza, Streptococcus pneumonia, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus аureus) на слизистой верхних дыхательных путей [1]. 

Для лечения острых и хронических заболеваний ВДП традиционно используются антибактериальные препараты (АБП), которые широко применяются в условиях первичного звена здравоохранения. Но зачастую бесконтрольное и необоснованное их применение ведет к значительному росту количества штаммов бактерий, устойчивых к различным АБП. В частности, выявлена устойчивость Staphylococcus aureus к метициллину, которая уже в 1990-х гг. достигла 30% среди клинических изолятов по всему миру; отмечается рост количества полирезистентных штаммов Klebsiella pneumonia и Escherichia coli, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия [2]. Наряду с недостаточной эффективностью, использование антибиотиков ведет к ряду побочных эффектов: повышает риск сосудистой смерти в 2,88 раз (макролиды); аллергическим реакциям в 5% случаев (пенициллины); хондро- и артротоксичности, гепатотоксичности (фторхинолоны); к развитию синдрома Стивена-Джонсона (Ко-тримоксазол); антибиотикоассоциированным диареям, псевдомембранозному колиту, вызванному C. difficile (любые АБП); способствуют появлению резистентных штаммов микроорганизмов, приводя к нарушению нормального микробного биоценоза различных биотопов, включая ВДП [3].

Растущая повсеместно устойчивость микроорганизмов к противомикробным препаратам и участившиеся вспышки инфекционных заболеваний, включая пандемию COVID-19, явились мощным стимулом для разработки лекарственных препаратов на основе натуральных продуктов растительного происхождения [4]. В растениях содержится большое разнообразие активных компонентов, что делает их богатым источником противомикробных средств в качестве альтернативы антибиотикам или компонентов, усиливающих их действие. Структурное разнообразие растительных компонентов обеспечивает реализацию их действия посредством различных механизмов, в отличие от традиционных противомикробных препаратов. Высокая биологическая активность растительных экстрактов может быть связана с тем, что различные метаболиты, входящие в экстракты, обладают синергидным эффектом.

Спектр антимикробного действия эфирных масел (ЭМ) и их компонентов затрагивает практически все группы микроорганизмов. Благодаря своей липофильности, эфирные масла могут легко проникать через бактериальную и вирусную мембраны, вызывая их разрыв, тем самым подавляя развитие бактерий, грибов, вирусов и различных видов простейших [4, 5, 6]. 

Большинство структурных соединений, образуемых растениями, являются вторичными метаболитами, которые являются неоднородными по биосинтезу и по структуре [7, 8]. Они проявляют антибактериальную активность in vitro и in vivo, причем большинство из этих соединений действуют как прямые ингибиторы роста, некоторые из них обладают антимикробными свойствами благодаря своим антитоксическим свойствам. В целом, антибактериальные свойства продуктов растительного происхождения включают ингибирование синтеза бактериальной клеточной стенки, разрушение клеточной мембраны, ингибирование синтеза бактериального белка, репликации ДНК и метаболических путей, что делает их оптимальными кандидатами для будущей разработки лекарственных средств [9, 10]. Кроме того, они могут ингибировать механизмы, участвующие в устойчивости бактерий к антибиотикам, включая сверхэкспрессию эффлюксных насосов, структурную модификацию поринов и модификацию антибиотик-мишень, что может привести к разработке новых подходов к преодолению устойчивости к антибиотикам [7, 11].

В этой связи, в последние годы наблюдается возрастание интереса к использованию инновационных антимикробных средств, которые являются потенциальной альтернативой традиционной антибиотикотерапии. Одним из перспективных направлений профилактики и лечения воспалительных заболеваний ВДП является использование ЭМ лекарственных растений путем введения в организм через дыхательные пути в виде ингаляций. ЭМ могут оказывать прямое воздействие на микробные агенты, являющиеся возбудителями воспалительных заболеваний ВДП, а также служить фактором для снижения резистентности к антибактериальным препаратам. В тоже время, современная фитотерапия должна опираться на доказательную научную базу, использовать стандартизованные и зарегистрированные лекарственные средства, иметь совместимость с другими фармакологическими препаратами и не обладать токсическими свойствами [12]. Таким характеристикам, по данным ряда авторов, соответствует композиция ЭМ – Масло Дыши [13, 14, 15]. 

Ряд исследований указывают на наличие у препарата «Масла Дыши» антимикробных свойств. Так, в работе коллектива авторов [16] показана ингибирующая активность композиции данных ЭМ в отношении способности условно-патогенных микроорганизмов к биопленкообразованию (БПО), что рассматривается как один из подходов к предотвращению развития антибиотикорезистентности. 

Учитывая выше изложенное, целью нашей работы явилось сравнительное исследование in vitro антибактериальной и антимикотической активности растительных эфирных масел, входящих в композицию «Масло Дыши», и самой композиции «Масло Дыши» в отношении условно патогенных микроорганизмов – возбудителей воспалительных заболеваний ВДП. 

Материалы и методы

В работе использовали эфирные масла гвоздики, можжевельника, перечной мяты, эвкалипта (OLEOS, Россия), а также композицию масел «Дыши» (АО «АКВИОН», Россия), в которую входят 6 натуральных растительных эфирных масел (эвкалиптовое, мятное, каепутовое, гвоздичное, можжевеловое, винтергриновое) и левоментол. В качестве объектов были выбраны тест-штаммы условно-патогенных микроорганизмов, наиболее часто вызывающие инфекционно-воспалительные заболевания верхних дыхательных путей: Staphylococcus aureus АТСС 25923, Klebsiella pneumoniae ICIS-278, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27653 и Candida albicans АТСС 24433. В качестве представителя нормобиоты верхних дыхательных путей был выбран штамм Staphylococcus epidermidis 25, изолированный от условно-здорового человека. Штаммы засевали газоном в чашки Петри с питательным агаром и культивировали 24 часа в условиях термостата (37℃). 

Для определения антимикробной активности эфирных масел и их композиции «Дыши» использовали метод диффузии в питательном агаре. Суспензию каждого исследуемого образца микроорганизма, разбавленную до 6×10⁴ клеток/мл, распределяли шпателем Дригальского на поверхности питательного агара в чашках Петри. Стерильные диски из фильтровальной бумаги (диаметром 6 мм) пропитывали 0,1 мл исследуемого эфирного масла и помещали на поверхность засеянного агара. Чашки инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Чувствительность штаммов определяли по диаметру зон ингибирования роста микроорганизмов (измеряли в миллиметрах).

Для исследования минимальной подавляющей активности композиции масел «Дыши» в отношении тест-штаммов были приготовлены её водные растворы, путем солюбилизации эфирных масел раствором полисорбат 20 с последующим серийным разведением до 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 и 1:32, что соответствовало концентрации эфирных масел 400,0 мг/мл, 200,0 мг/мл, 100,0 мг/мл, 50,0 мг/мл и 25,0 мг/мл [17]. Изучение роста, размножения микроорганизмов в присутствии ряда разведений композиции масел «Дыши» проводили фотометрическим методом на приборе Elx808 (BioTek, США) с последующим высевом тест-штаммов методом секторного посева на твердый питательный агар и культивированием их в течение 24 часов в термостате. В результате были определены значения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) и минимальной бактерицидной концентрации (MBC) композиции «Дыши» в отношении тест-штаммов.

Все эксперименты выполнены не менее, чем в трех дублях. Полученные результаты обработаны статистически с вычислением непараметрического критерия Манна-Уитни (р≤0,05).

Результаты и обсуждение

В работе установлено, что в отношении грибов рода Candida умеренным антимикробным действием обладало масло гвоздики (6,8±0,5 мм), а более заметную задержку роста вызвало масло «Дыши» (11,8±1,2 мм) (р≤0,05). Остальные эфирные масла не проявляли антимикробного действия в отношении грибов. Выраженную задержку роста золотистого стафилококка оказывала композиция масел (9,67±0,6 мм) (р≤0,05), другие исследуемые масла не влияли на рост данной культуры (рис. 1 А). Подобная закономерность была выявлена и при исследовании влияния масел на рост штаммов клебсиеллы и псевдомонады: заметную задержку роста вызвало масло «Дыши» (12,4±1,3 мм и 9,5±0,7 мм, соответственно, р≤0,05) и отсутствовала выраженная задержка роста указанных бактериальных культур у других исследуемых масел. Следует отметить, что в отношении эпидермального стафилококка, являющегося представителем нормобиоты, не выявлено существенного влияния на его рост всех исследуемых масел и композиции (рис. 1 Б).

Оценивая антимикробное действие масла гвоздики, выявленное в данном исследовании (преимущественно в отношении грибов рода Candida), следует отметить, что эвгенол, являющийся основой этого масла, относится к биологически активному соединению, содержащемуся во многих травянистых растениях, в том числе источником его является и гвоздика. Терапевтические свойства эвгенола проявляются в антиоксидантной, противомикробной, анестезирующей, противовоспалительной, антиканцерогенной и противодиабетической активности [18].

В настоящее время прогресс в разработке лекарств сосредоточен на внедрении новых препаратов, которые могут одновременно ингибировать ключевые ферменты, участвующие в пути биосинтеза эргостерола. Как известно, эргостерол является ключевым стероидным компонентом клеточной мембраны грибов, включая плесневые и дрожжевые грибы. Любое снижение уровня эргостерола в клеточной мембране грибов делает их уязвимыми к повреждению клеточной мембраны и даже ее гибели. Большинство противогрибковых препаратов нацелены на ключевые ферменты, участвующие в пути биосинтеза эргостерола: сквален-эпоксидаза (SE) и 14α-деметилаза (CYP51 – член семейства цитохромов Р450). Одним из таких хорошо зарекомендовавших себя природных противогрибковых фитохимикатов является эвгенол. В экспериментальных исследованиях Jignesh Prajapati с соавт. (2022) установлено участие эвгенола в ингибировании обоих ферментов, необходимых для биосинтеза эргостерола [19]. Таким образом, наши данные совпадают с результатами исследований других авторов о противогрибковой активности ЭМ гвоздики. 

После определения антимикробной активности композиции масел «Дыши» в отношении исследуемых тест-штаммов, которые оказались чувствительны к действию препарата, были определены значения MIC и MBC композиции. В результате было установлено, что изучаемые параметры варьировали в зависимости от вида тест-штаммов. Данные представлены в таблице 1, которая демонстрируют, что наибольшую чувствительность к действию препарата «Дыши» проявляли культуры K. pneumoniae ICIS-278 и C. albicans АТСС 24433. Так, минимальная подавляющая концентрация сохранялась при разведении препарата в 16-32 раза, а минимальная бактерицидная - в 4-8 раз. Для культур S. aureus АТСС 25923 и P. aeruginosa АТСС 27653 показатели MIC и MBC составляли, соответственно, 50,0-100,0 мг/мл (1:16-1:8) и 200,0-400,0 мг/мл (1:4 и 1:2), что также свидетельствовало о выраженном антимикробном эффекте композиции масел «Дыши».

Таблица 1. Показатели MIC и MBC композиция масел «Дыши» в отношении тест-штаммов
Table 1. MIC and MBC indicators of «Dyshi» oil composition in relation to test strains

Как известно, существуют тысячи структурно различных соединений, производимых растениями (полифенолы, терпеноиды, фенольные кислоты, эфирные масла, лектины, полипептиды и алкалоиды), каждое из которых обладает различными биологическими свойствами, которые обеспечивают в том числе, и антимикробные свойства [20]. Разрушение плазматической мембраны является наиболее распространенным механизмом противомикробного действия ЭМ. Количество и положение фенольных гидроксильных групп, двойных связей, делокализованных электронов и конъюгация с сахарами в случае флавоноидов, имеют решающее значение для антимикробной активности ЭМ [10]. 

Оценивая в целом антимикробные свойства ЭМ, следует отметить, что для адекватной противомикробной эффективности эфирных масел зачастую требуется комбинация различных вторичных метаболитов, что используется в композициях масел. Как известно, масло «Дыши» – это композиция из 6 натуральных эфирных масел (эвкалиптовое, мятное, каепутовое, гвоздичное, винтергриновое, можжевеловое) и левоментола (АО «АКВИОН», Россия), обладающих антисептическими, противовоспалительными и тонизирующими свойствами. Важное значение использование композиций эфирных масел и их паров имеет в борьбе с биопленочными и персистирующими инфекциями [21]. Как выше указывалось, нами ранее были получены данные о способности паров «Масло Дыши» подавлять персистентный потенциал условно-патогенных бактерий и дрожжеподобных грибов путем снижения их способности к биопленкообразованию и инактивации лизоцима (антилизоцимная активность – АЛА) на популяционном уровне [16]. 

Результаты, полученные в настоящем исследовании, подтверждают выраженный синергидный антибактериальный и антимикотический (в отношении грибов рода Candida) эффект натуральных эфирных масел, входящих в композицию «Масло Дыши», и целесообразность использования данного препарата для лечения и профилактики острых и хронических заболеваний верхних дыхательных путей у детей микробной этиологии. Особое значение приобретают полученные нами результаты об отсутствии негативного влияния композиции масел «Дыши» на рост штамма эпидермального стафилококка, являющегося представителем нормобиоты, колонизирующей кожу и слизистые верхних дыхательных путей. Тем самым использование композиции «Масло Дыши» не нарушает колонизационную резистентность слизистой дыхательных путей, обеспечивая эффективность и избирательность антимикробного действия данной композиции ЭМ.

Заключение

Таким образом, результаты наших исследований подтверждают эффективность антимикробного действия композиции «Масло Дыши», как в отношении условно-патогенных бактерий, так и дрожжеподобных грибов. Обращает внимание, что композиция ЭМ, оказывала более выраженный антимикробный эффект по сравнению с каждым отдельно взятым маслом, ее образующим, что свидетельствует о выраженном синергидном действии подобранных в исследуемую композицию масел в отношении условно-патогенных бактерий и грибов рода рода Candida. Отсутствие ингибирующего влияния данной композиции ЭМ на рост эпидермального стафилококка, являющегося представителем нормобиоты верхних дыхательных путей и кожи, следует рассматривать как вариант возможного избирательного эффекта масла «Дыши», направленного на поддержание колонизационной резистентности биотопа ВДП.

Литература:

1. Захарова И.Н., Касьянова А.Н., Климов Л.Я., Курьянинова В.А., Симакова М.А., Дедикова О.В., Кольцов К.А. Микробиом респираторного тракта: что известно сегодня? Педиатрия. Consilium Medicum, 2018;4:10-17. DOI: 10.26442/24138460.2018.4.180129
2. Землянко О.М., Рогоза Т.М., Журавлева Г.А. Механизмы множественной устойчивости бактерий к антибиотикам. Экологическая генетика, 2018;16(3):4-17. DOI: 10.17816/ecogen1634-17
3. Андрюков Б.Г., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Перспективные стратегии поиска новых средств борьбы с инфекционными заболеваниями. Антибиотики и химиотерапия, 2018;63(1-2):44-55.
4. Elsebai M.F., Albalawi M.A. Essential Oils and COVID-19. Molecules. 2022;27(22):7893. 
5. Лыков И.Н. Исследование противогрибковой активности действия эфирных масел. Тенденции развития науки и образования. 2019;51:17-20. 
6. Dhifi W. Essential Oils’ Chemical Characterization and Investigation of Some Biological Activities: A Critical Review. Medicines. 2016:3(25):2-6. URL:www.mdpi.com/journal/medicines (accessed: 12.06.2021).
7. Porras G., Chassagne F., Lyles J.T., Marquez L., Dettweiler M., Salam A.M., et al. Ethnobotany and the Role of Plant Natural Products in Antibiotic Drug Discovery. Chem. Rev. 2021;121:3495–3560. doi: 10.1021/acs.chemrev.0c00922. 
8. Vaou N., Stavropoulou E., Voidarou C., Tsigalou C., Bezirtzoglou E. Towards Advances in Medicinal Plant Antimicrobial Activity: A Review Study on Challenges and Future Perspectives. Microorganisms. 2021;9:2041. doi: 10.3390/microorganisms9102041
9. Gorlenko C.L., Kiselev H.Y., Budanova E.V., Zamyatnin A.A., Ikryannikova L.N. Plant Secondary Metabolites in the Battle of Drugs and Drug-Resistant Bacteria: New Heroes or Worse Clones of Antibiotics? Antibiotics. 2020;9:170. doi: 10.3390/antibiotics9040170
10. Álvarez-Martínez F.J., Barrajón-Catalán E., Herranz-López M., Micol V. Antibacterial plant compounds, extracts and essential oils: An updated review on their effects and putative mechanisms of action. Phytomedicine. 2021;90:153626. doi: 10.1016/j.phymed.2021.153626
11. Khameneh B., Diab R., Ghazvini K., Fazly Bazzaz B.S. Breakthroughs in bacterial resistance mechanisms and the potential ways to combat them. Microb. Pathog. 2016;95:32–42. doi: 10.1016/j.micpath.2016.02.009
12. Холодова И.Н. Современная фитотерапия: возможности и перспективы её использования в лечебных программах у детей. Медицинский совет, 2017; 1:122-127. DOI: 10.21518/2079-701X-2017-1-122-127
13. Карпова Е.П., Вагина Е.Е. Возможности использования эфирных масел в комплексной терапии острых респираторных заболеваний у детей. Российский вестник перинатологии и педиатрии, 2016;1:104-109.
14. Николаева С.В., Шушакова Е.К., Хлыповка Ю.Н. Профилактика и лечение острых респираторных инфекций в педиатрической практике – фокус на применение эфирных масел. РМЖ, 2020;6:23-27.
15. Пухов А.А. Эфирные масла с антимикробными и противовирусными свойствами для медицинской практики. Журнал Поликлиника, 2022; 1:76-79.
16. Челпаченко О.Е., Данилова Е.И., Чайникова И.Н., Иванова Е.В., Перунова Н.Б. Эфирные масла лекарственных растений в коррекции микробиоценоза верхних дыхательных путей у детей с риносинуситом. Вопросы практической педиатрии, 2021;16(6): 112-121.DOI: 10.20953/1817-7646-2021-6-112-121
17. Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н., Груднина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии. Тверь: ООО «Издательство «Триада»; 2004. 312 с.
18. Mohammed J.A., Mohamad T., Sarwar B., Surajpal V., Sadaf G.J., Perwaiz A. A Review of Eugenol-based Nanomedicine: Recent Advancements, Current Bioactive Compounds. 2021;17(3). doi.org/10.2174/1573407216999200525145633
19. Prajapati J., Goswami D., Dabhi M., Acharya D., Rawal R.M. Potential dual inhibition of SE and CYP51 by eugenol conferring inhibition of Candida albicans: Computationally curated study with experimental validation, Computers in Biology and Medicine. 2022;151:106237 doi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.106237
20. Qassadi F.I., Zhu Z., Monaghan T.M. Plant-Derived Products with Therapeutic Potential against Gastrointestinal Bacteria. Pathogens. 2023:12(2):333. doi: 10.3390/pathogens12020333
21. Zeineldin M., Esmael A., Al-Hindi R.R., Alharbi M.G., Ashenafi Bekele D., Teklemariam A.D. Beyond the Risk of Biofilms: An Up-and-Coming Battleground of Bacterial Life and Potential Antibiofilm Agents. Life (Basel). 2023:13(2):503. doi: 10.3390/life13020503